כיול מערכת להפקת דנ"א חיידקי בשתן

הקדמה:

במשך עשרות שנים ההנחה המדעית הרווחת הייתה כי באדם בריא השתן הוא נוזל סטרילי. לאחרונה נמצא בנבדקים בריאים כי גם במערכת השתן, בדומה למערכות מוקוזליות נוספות, ישנן אוכלוסיות של חיידקים קומנסאליים אשר מאכלסים אותה. כיום על ידי שימוש בשיטות מולקולריות מתקדמות ניתן לרצף אוכלוסיות שונות של חיידקים שאינן ניתנות לגידול בשיטות מיקרוביולוגיות קלאסיות. השיטה המולקולרית הנפוצה ביותר כיום לאיפיון חיידקים בדגימה היא על ידי ריצוף הגן החיידקי של ריבוזום הרנ"א S16. בעבודה זו מתוארת מערכת להפקת דנ"א חיידקי בשתן.

שיטות:

דגימת שתן מנבדק בריא אשר סוננה עם מסנן בקוטר 0.2 מיקרון, על מנת לסלק חיידקים קומנסלים חולקה לדגימות של 2 מ"ל. כל דגימה נזרעה עם חיידקי ציטרובקטר רודנטיום (Citrobacter Rodentium) בריכוז של ידוע של 5^10*3.000 חיידקים/מיקרוליטר. דנ"א חיידקי הופק על ידי שתי ערכות מסחריות שונות: MoBio™ ו-Invitrogen™. נבדקו תנאי סרכוז שונים (10g,5g) במשכי זמן שונים (10 ו-5 דק`) והדגימות הוקפאו ב-°80-. אמפליפיקציה של המקטע ההיפר וריאבילי V3-4 בגן החיידקי לריבוזום S16 בוצעה על ידי פריימרים ספציפיים 515F 814R במכשיר qPCR של חברת Applied-Biosystems™. ריכוזי החיידקים בדגימה חושבו והושוו בין הערכות ומהירויות הסרכוז השונות.

תוצאות:

ריכוז החיידקים שהתקבל על ידי Invitrogen היה קרוב יותר למספר החיידקים הצפוי בדגימה. נמצאו 2^10*1.148 חיידקים/מיקרוליטר לעומת ריכוז צפוי של 3^10*1.500 חיידקים/מיקרוליטר וגבוה ב-68.5% יותר מאשר על ידי MoBio. סרכוז במהירות 10g ל-10 דק` הביא להפקת חיידקים בכמות גדולה יותר ב-5.4% ו-156.7% בהשוואה לסרכוז במהירות 10g ל-5 דק` ו-5g ל-5 דק` בהתאמה.

מסקנות:

הערכה של Invitrogen™ בסרכוז של 10g למשך 10 דק` הביאה להפקת דנ"א חיידקי בשתן בכמות הדומה ביותר למספר החיידקים שהוספו לשתן.