סטנדרטיזציה של בדיקת מיקרוביום בשתן

הקדמה:

המחקר של המיקרוביום עבר מהפכה בשנים האחרונות על ידי שימוש בשיטות אנליטיות שאינן תלויות בתרבית, כגון ריצוף של גן ה-16S החיידקי המקודד ל-rRNA. במשך עשרות שנים ההנחה המדעית הרווחת הייתה כי במצב תקין השתן הוא נוזל סטרילי ובשנים האחרונות נמצא כי למיקרוביום בשתן עשויה להיות השפעה על מצבים אורולוגים שונים (כיס נוירוגני, פרוסטטיטיס כרונית ועוד). מטרת העבודה ליצור סטנדטיזציה של מערכת לאיפיון המיקרוביום בשתן לצורך מחקרים אורולוגים עתידיים.

שיטות:

הפקת דנ"א משתן של נבדקים בריאים בוצעה ידי ערכות מסחריות שונות ™MoBio ו-™Invitrogen. בוצעה השוואה בין עיבוד דגימות שתן קפואות לדגימות טריות. נבדקו פרמטרים שונים: מהירות סרכוז (10,000g, 5,000g) משכי סרכוז (10 ו-5 דק`), אנזימי PCR שונים, פרמטרים שונים של ריאקציית PCR (מספר מחזורים) וכן בוצעה השוואה בין סביבות עבודה שונות, השפעת עובד המעבדה והשפעת אפקט אצווה (Batch effect).

תוצאות: ריכוז החיידקים המחושב על ידי Invitrogen היה גבוה ב-185% יותר מאשר על ידי MoBio. לא נמצא הבדל בין דגימות קפואות לטריות. ריכוז החיידקים המחושב הגבוה ביותר נמצא בסרכוז של 10,000g למשך 10 דק`. עליה בכמות מחזורי ה-PCR הביאה לכמות קריאות גבוהה יותר של הדגימות אך לא השפיעה על אחוז השכיחות היחסית (Relative-abundance,RA) של החיידקים בדגימה. אנזים Phusion-High-fidelity הביא למספר הקריאות הגבוה ביותר בדגימות השתן. תוצאות דומות נמצאו בסביבות עבודה שונות ועל-ידי עובדי מעבדה שונים.

מסקנות: כיילנו מערכת להפקת מיקרוביום בשתן. שימוש בפרוטוקול שפיתחנו עשוי לשמש לריצוף דגימות שתן במחקרים עתידיים. בדגימות שתן בהן ריכוז החיידקים נמוך יש להיזהר בכל שלבי עיבוד הדגימות. לאפקט אצווה עשויה להיות השפעה מכרעת על התוצאות המתקבלות ויש צורך בביקורת שלילית וחיובית בכל שלבי הניסוי.